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刺参GPR54-Like筛选克隆及特征研究

作者2019-03-27 09:35未知
刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea)、刺参科(Stichopodidae)、仿刺参属(Apostichopus),属后口动物,在无脊椎动物中具有较高的进化地位。由于刺参具有较为独特的生理现象,如再生、夏眠、吐肠、自溶等等,其相关基础研究得到了海洋生物学家的关注并获得了快速发展。GPR54(G protein coupled receptor 54)是神经肽Kisspeptin的内源性受体,在动物的生殖发育过程中发挥重要作用。本研究利用分子克隆、生物信息学分析、表达载体构建、体外表达等技术手段,开展刺参GPR54-like(AjGPR54L)基因克隆及序列特征分析,通过GFP荧光蛋白融合表达AjGPR54L的亚细胞定位及其在不同组织的转录表达差异研究,初步探讨AjGPR54L受体结构与功能特征,为深入揭示GPR54受体在刺参中的功能活性及调控机制奠定基础。主要获得以下研究结果:利用公开发布的刺参转录组数据库,经过合并拼接及处理,共计获得91,824条Unigenes,平均长度702 bp,N50为1135 bp,18,955条Unigene获得注释信息,通过刺参转录组数据的筛选分析,共获得GPCRs(G protein coupled receptor,GPCR)预测序列988条,根据其注释基因信息,获得GPR54基因名注释的序列片段。基于刺参GPR54-Like基因核心片段设计引物,采用5,和3,cDNA末端快速扩增技术(rapid amplication of cDNA ends,RACE)技术获得AjGPR54L的全长序列,并对其序列特征进行生物信息学分析,结果表明,AjGPR54L(MG199220)序列全长为1454 bp,其中包含编码330个氨基酸的993 bp开放阅读框(open reading frame,ORF),191 bp的5'非翻译区(untranslated region,UTR)以及270 bp的3'UTR。预测蛋白质的分子量(Mw)为37.83 kDa、等电点(pI)为9.81。通过预测发现AjGPR54L的氨基酸序列包含:1个N-连接糖基化位点,5个ASN-XAA-Ser/Thr序列,1个细胞外的N端结构域(N9),34个磷酸化位点和5个酪氨酸位点,具有典型的七次跨膜结构,有三个胞外环(EC)和三个胞内环(IC)。通过对AjGPR54L受体性质及定位进行分析,发现获得的AjGPR54L主要定位在细胞膜上。将构建的AjGPR54L-EGFP的融合表达质粒瞬时转染至HEK293细胞,经激光共聚焦扫描显微镜显示,细胞膜上观察到明显的绿色荧光信号;表明HEK293细胞中表达的Aj GPR54L受体蛋白定位于细胞膜,AjGPR54L-EGFP蛋白中C-末端EGFP(enhanced green fluorescence protein,EGFP)标记不影响AjGPR54L表达和到膜。此外,对AjGPR54L表达的组织差异性进行分析,运用实时荧光定量PCR方法检测成年刺参AjGPR54L基因在刺参呼吸树、消化道、体壁、肌肉、神经环、雌性性腺中的定量表达,结果表明:AjGPR54L在刺参不同组织中均有表达且表达量存在差异,在神经环中表达量显著高于其他组织;在呼吸树、消化道、体壁、肌肉及雌性性腺中表达量差异不显著。本研究结果初步揭示了刺参GPR54L编码基因及蛋白的特征,阐明了AjGPR54L分布及表达特征,并为进一步探索此受体的信号通路及调控机制奠定了基础。
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