阳离子聚合物修饰的埃洛石纳米管作为基因载体
作者2019-04-17 10:40未知
利用纳米材料独特的性质将其设计为非病毒载体治疗癌症的研究,是近年来纳米材料和癌症治疗的研究热点之一。本论文将天然无机纳米材料-埃洛石纳米管(HNTs)用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和聚酰胺胺(PAMAM)进行修饰,系统研究了其作为基因载体对癌症的体内外治疗效果。进而用斑马鱼模型对HNTs的体内外毒性进行了系统的研究。具体内容如下:(1)设计了一种基于PEI修饰HNTs(PEI-g-HNTs)的非病毒基因载体。为了增加入胞效率,HNTs首先通过短管化处理来减小尺寸,然后接枝PEI来作为递送绿色荧光蛋白(GFP)标记的质粒DNA(pDNA)的载体。PEI-g-HNTs的结构形态和物理化学性质通过多种测试方法来表征。实验证明PEI-g-HNTs比PEI具有更低的细胞毒性。带正电荷的PEI-g-HNTs能在氮磷比为5:1到40:1的范围内稳定结合pDNA。对于293T和HeLa细胞,在相同的氮磷比下,PEI-g-HNTs/pDNA络合物比PEI/pDNA络合物拥有更高的转染效率。在氮磷比20:1时,PEI-g-HNTs/pDNA络合物对HeLa细胞的转染率可以达到44.4%。蛋白质印迹法表明PEI-g-HNTs/pDNA络合物比PEI/pDNA络合物拥有更高的GFP蛋白表达。实验结果表明PEI-g-HNTs是一种新颖的基因载体,它具有很好的生物相容性和很高的转染效率,在癌症的基因治疗中有着广阔的应用场景。(2)构建了PAMAM修饰的HNTs(PAMAM-g-HNTs)用于siRNA递送治疗乳腺癌的新型非病毒基因载体。多种表征方法证明了PAMAM-g-HNTs的成功制备,改性后的HNTs表面带有+19.8 mV的电荷,具有负载基因的能力。同时用细胞毒性实验证明了PAMAM-g-HNTs良好的细胞相容性。细胞转染实验结果表明乳腺癌细胞(MCF-7)对PAMAM-g-HNTs/siRNA有着很高的细胞摄入水平,远远高于Lipo2000转染试剂。细胞凋亡实验也证实了PAMAM-g-HNTs/siVEGF比Lipo2000/siVEGF有着更好地诱导细胞凋亡能力。小鼠动物实验表明,PAMAM-g-HNTs/siVEGF的体内抗癌效果非常明显,高于Lipo2000/siVEGF。同时PAMAM-g-HNTs/siVEGF基因递送系统不会对小鼠其他主要器官造成副作用影响。体内影像学分析结果表明PAMAM-g-HNTs能够缓慢释放siVEGF的作用。所有结果表明PAMAM-g-HNTs是一种高效的基因载体,能够在体内和体外对乳腺癌进行有效地抑制。(3)用细胞和斑马鱼模型对HNTs的体内和体外毒性进行了研究。为了更加清晰地观察HNTs在斑马鱼体内的分布情况,HNTs用异硫氰酸荧光素(FITC)进行了标记。细胞毒性实验、细胞凋亡法和活性氧测试法都表明HNTs对人体正常细胞和癌细胞都具有很好的细胞相容性。当HNTs(200μg/mL)与细胞培育72小时后,细胞的活性依然高于60%。激光共聚焦显微镜观察到FITC-HNTs被细胞摄入的情况。斑马鱼模型实验表明不同浓度的HNTs对斑马鱼胚胎和幼体没有急性毒性,同时浓度小于25 mg/mL的HNTs还能促进斑马鱼的孵化。电镜实验观察到HNTs能富集在斑马鱼胚胎卵膜上,但对斑马鱼胚胎没有毒副作用。实验结果表明,HNTs被斑马鱼吞食后主要分布在其胃肠道,同时还能被斑马鱼排泄出去。所有的结果表明,HNTs是一种环境友好型的纳米材料,它在各个领域的发展应用是相对安全的。
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